Određivanje šećera tankoslojnom kromatografijom

Cilj je ove vježbe određivanje slobodnih šećera iz citrusnog voća (limun, naranča, mandarina ili grejp). Nakon izolacije šećeri se mogu odrediti tankoslojnom kromatografijom (TLC – Thin Layer Chromatography) usporedbom sa standardima šećera.

Nakon izolacije, određuju se kemijska i fizikalna svojstva izolirane tvari, kao što je topljivost, ionski naboj, hidrofobnost, itd. Ako izolirani spoj pokazuje veliku sličnost s već poznatim spojevima, potrebno je izabrati tehniku izolacije koja ističe ona svojstva po kojima se taj spoj razlikuje. Kromatografija je jedna od tehnika za izolaciju spojeva.

Kromatografija je metoda odjeljivanja tvari iz smjese, zasniva se na selektivnoj adsorpciji ili na djelomičnoj razdiobi tvari između dviju faza sustava. U svim vrstama kromatografije postoje mobilna (pokretna) faza (MF) ili eluens i stacionarna (nepokretna) faza (SF), između kojih se raspodijele sastojci iz smjese te se na taj način razdvajaju. Kromatografski proces predstavlja stanje dinamičke ravnoteže nekog spoja između mobilne i stacionarne faze. Tijekom kromatografskog procesa stalno se odvijaju adsorpcija i desorpcija. Dolazi do niza uzastopnih razdjeljenja između dviju faza uzrokovanih putovanjem mobilne faze. Do razdvajanja sastojaka smjese dolazi zbog različito jake apsorpcije sastojaka ili različitog koeficijenta razdjeljenja između mobilne i stacionarne faze.

Pri adsorpcijskoj kromatografiji stacionarna faza je kruta, a mobilna je tekuća. Pri razdjelnoj kromatografiji stacionarna faza je tekuća, a mobilna može biti i tekuća (HPLC – High Pressure Liquid Chromatography) i plinovita (GC – Gas Chromatography).

Što se tvari iz smjese više razdvoje, kromatografija je uspješnija. Na uspješnost kromatografije utječu:

• brzina mobilne faze
• temperatura sustava
• omjer mase odjeljivane tvari i mase stacionarne faze
• veličina i oblik (površina) čestica stacionarne faze
• vrsta sastojaka.

U adsorpcijskoj kromatografiji kao mobilna faza koriste se otapala koja se razlikuju sposobnošću desorpcije (eluiranja) tvari sa stacionarne faze.

Što je tvar jače vezana na stacionarnu fazu, koristimo se otapalom ili smjesom otapala s većom moći eluiranja (bliže početku niza). U organskom laboratoriju najčešće se izvode:

• tankoslojna kromatografija (TLC – Thin Layer Chromatography)
• kromatografija na stupcu ili koloni
• plinska kromatografija (GC).

Najčešće se koristi metoda adsorpcijske kromatografije na tankom sloju adsorbensa (stacionarna faza) nanesenom na staklenu ploču ili foliju. Kao adsorbensi pretežno se rabe silikagel (silicijeva kiselina) i aluminijev oksid.

Stacionarna faza – silikagel ili silicijeva kiselina predstavljaju zakiseljenu otopinu silikata (H₂SiO₃). Silikagel posjeduje veliku specifičnu površinu, što znači da odjednom može vezati veliki broj molekula. Površina je sastavljena od Si–OH skupina koje predstavljaju aktivna mjesta i snažno privlače polarne organske molekule. Atomi silicija polarizirani su zbog veze s elektronegativnijim atomima kisika, a atomi kisika mogu stvarati vodikove veze s uzorkom i s molekulama vode. Takva aktivna mjesta mogu se deaktivirati ako se na njih adsorbira vlaga iz zraka. Zagrijavanjem i uklanjanjem vode u sušioniku pločica se opet aktivira.

Mobilna faza – ima dvije funkcije – nosi uzorak preko kromatografske pločice i natječe se s uzorkom za aktivna mjesta na stacionarnoj fazi. Ako je mobilna faza jako polarna, spriječit će vezanje uzorka na stacionarnu fazu pa će uzorak vrlo brzo putovati preko nje. Smanjenjem polarnosti mobilne faze uzorak se jače veže na stacionarnu fazu i sporije putuje.

TLC se ne može koristiti za velike količine uzorka, ali metoda je brza pa se koristi kao potvrda pri identifikaciji nepoznatih uzoraka. Uzorak se nanosi blizu dna kromatografske pločice na startnu liniju. Startna linija mora biti iznad mobilne faze tako da uzorak nije potopljen. Pločica se postavi u posudu za razvijanje kromatograma tako da je mobilna faza ispod startne linije. Zbog kapilarnih sila mobilna faza putuje prema vrhu pločice noseći sobom i uzorak. Razvijanje kromatograma je završeno kada mobilna faza dosegne gotovo vrh pločice. Linija do koje stigne mobilna faza naziva se fronta otapala. S obzirom na to da se tvari iz uzorka adsorbiraju na stacionarnu fazu različitim afinitetima, ne dosegnu frontu otapala istodobno s mobilnom fazom. Mjereći udaljenost koju su tvari iz uzorka prevalile i uspoređujući te vrijednosti sa standardima, moguće je ustanoviti od kojih tvari se uzorak sastoji.

Svaki spoj ima određenu R_F vrijednost pri istim uvjetima, kao što su mobilna faza, temperatura, stacionarna faza, itd. Zbog tih zahtjevnih uvjeta, uz nepoznati uzorak uvijek se nanose i uzorci poznatih tvari, tzv. standardi.