Određivanje šećera u voćnom soku

Izabrani plod potrebno je iscijediti u čašu (dobije se oko 70 mL iz naranče ili limuna, ili oko 250 mL iz grejpa, što je više nego dostatno za cijelu skupinu učenika). Voćnu pulpu možete ukloniti filtriranjem ili cijeđenjem kroz staničevinu. Proteini iz soka uklanjaju se tako da se 1 mL soka u epruveti pomiješa s 3 mL etanola. Većina proteina je netopljiva u etanolu. Etanol denaturira proteine te oni koaguliraju. Denaturirani proteini uklanjaju se centrifugiranjem.

Kromatografske pločice smiju se primati i držati samo za rubove da ne ostanu otisci prstiju na aktivnoj površini koji ometaju putovanje uzorka i mobilne faze. Na rubove izrezane kromatografske pločice običnom olovkom naznačite startnu liniju (oko 2 cm od kraja pločice). Na startnu liniju olovkom označite mjesta i nanesite uzorak i standarde šećera tri puta po 1 μL na jednakoj udaljenosti, ali tek kada se prethodna kap potpuno osušila. Nanošenjem malih volumena uzorka i standarda mrlje će ostati male i koncentrirane. Uzorak i standarde nanosite pomoću mikropipete. Za svaki standard i uzorak potrebno je koristiti novi nastavak za mikropipetu ili novu staklenu kapilaru.

U posudu za razvijanje kromatograma unosi se mobilna faza (u volumnom omjeru etilni acetat : izopropanol : voda : piridin = 26 : 14 : 7 : 2) tako da razina mobilne faze u posudi bude oko 1 cm. Pločica se postavi okomito u posudu (rub sa startnom linijom treba biti okrenut prema dolje). Pri tome treba paziti da startna linija i nanešeni uzorci nisu uronjeni u mobilnu fazu. Posudu je potrebno prekriti staklenom pločom da se atmosfera zasiti parama mobilne faze. Postupak se prekida kad mobilna faza dođe do otprilike 2 cm od gornjeg ruba. Pločica se izvadi iz posude, a običnom olovkom se označi fronta otapala. Pločicu treba posušiti prije detekcije mrlja.

Za detekciju otopite 20 mg difenilamina u 10 mL koncentrirane sumporne kiseline. Nakon otapanja kiselu otopinu difenilamina prelijte u raspršivač-bočicu u kojoj se nalazi 1 mL anilina. Detekcija se provodi u digestoru uz gumene rukavice zbog velike otrovnosti difenilamina i anilina!!! Kromatogram treba poprskati reagensom tako da bude potpuno vlažan, ali ne tako da reagens kaplje s pločice. Kromatogram se zagrije na 105 °C u sušioniku tijekom 5 minuta. Vidljive su obojene mrlje koje nastaju reakcijom reagensa i reducirajućih šećera. Pozornost valja obratiti na mrlje dok su svježe! Stajanjem se boja mrlja mijenja u smeđu. Mrlje aldoheksoza su smeđaste, a aldopentoza crvenkaste, no raspon boja varira od crne preko zelene do zlatne.