Utjecaj koncentracije enzima na brzinu reakcije

Dio biokemije koji proučava enzimatsku aktivnost naziva se enzimatska kinetika. Kinetika proučava brzine enzimski kataliziranih reakcija, kao i uvjete koji djeluju na ravnotežu i brzinu tih reakcija.

Kao i svaka druga kemijska reakcija, i brzina enzimatskih reakcija iskazana je promjenom koncentracije supstrata ili produkta u odnosu na vrijeme reakcije. Brzina nastanka produkta je funkcija na koju djeluju mnogi čimbenici: koncentracije enzima i supstrata, vrijeme trajanja reakcije, pH-vrijednost i temperatura medija, koncentracija aktivatora ili inhibitora koji mogu biti prisutni u mediju, itd.

Prvotna istraživanja enzimatski kataliziranih reakcija (Michaelis i Menten, 1913.) utvrdila su da brzina reakcije raste s porastom koncentracije supstrata. No, pri visokim koncentracijama supstrata brzina reakcije doseže zasićenje. Michaelis i Menten rezultate svojih istraživanja prikazali su u obliku jednadžbe:

To znači da je Michaelis – Mentenova konstanta jednaka koncentraciji supstrata kod koje je brzina reakcije jednaka polovici maksimalne brzine reakcije. Pomoću tih dviju konstanti, [latex]v_{\max }[/latex] i [latex]K_M[/latex], moguće je opisati svaki enzim. [latex]v_{\max }[/latex] pokazuje kako brzo enzim troši supstrat, a [latex]K_M[/latex] pokazuje koliko je supstrata potrebno da bi reakcija napredovala. [latex]v_{\max }[/latex] je ekstrapolacija na beskonačnu [latex]\lbrack S\rbrack[/latex].

U eksperimentalnim se uvjetima nikada ne može postići ona brzina reakcije koja bi bila jednaka teorijskom maksimumu. I kad je koncentracija supstrata desetak puta veća od KM, brzina reakcije doseže tek oko 90 % maksimalne brzine. Razlog leži u pojavi koja se naziva zasićenje enzima supstratom, tj. ograničen je broj aktivnih središta enzima. Pri niskim koncentracijama enzima, brzina katalize supstrata veća je od brzine vezanja nove molekule supstrata na enzim. Posljedica je gotovo linearno povećanje brzine reakcije ako povećavamo koncentraciju supstrata. No, pri visokim koncentracijama supstrata aktivna središta enzima postaju zasićena supstratom, brzina reakcije se smanjuje dok ne dosegne zasićenje.

Teorijsko objašnjenje Michaelis-Mentenove jednadžbe ponudili su biokemičari Briggs i Haldane godine 1925. Reakcijski put enzimatski kataliziranih reakcija prolazi preko enzim – supstrat kompleksa:

Enzim–supstrat kompleks može predstavljati i nekoliko prijelaznih međureakcija. Taj kompleks može disocirati ponovno na slobodni enzim i supstrat, ili može katalizirati nastanak produkta i slobodnog enzima. Enzim je pravi katalizator jer se može “reciklirati” i provesti višestruke pretvorbe supstrata u produkt. Pri niskim koncentracijama produkta može se zanemariti povratna reakcija vezanja produkta na enzim pri čemu nastaje enzim–supstrat kompleks. Ipak, ako se produkt koncentrira na mjestu nastanka, i sam produkt može djelovati kao inhibitor reakcije (tzv. povratna sprega).

U ovom pokusu koristi se kateholaza iz ekstrakta krumpira. Koncentraciju enzima mijenjamo razrjeđivanjem pomoću puferske otopine. Ekstrakt krumpira pripremamo ribanjem krumpira i miješanjem s otopinom pufera (1 : 10). Ekstrakt se mora čuvati u hladnjaku kako bi se očuvala enzimska aktivnost.

Fosfatni pufer priprema se miješanjem 3,9 mL otopine NaH₂PO₄ (c = 0,2 mol dm^–3), 6,1 mL otopine Na₂HPO₄ (c = 0,2 mol dm^–3) i 40 mL vode.

Mjerenje enzimske aktivnosti provodi se u puferskoj otopini čiji je pH = 7, jer je to pH-vrijednost optimalnog djelovanja kateholaze. Destilirana voda bez dodatka pufera ima nižu pH-vrijednosti, koji znatno usporava enzimsku reakciju.

Pripravite stalak sa sedam epruveta prema tablici:

U prvu epruvetu dodajte 0,5 mL otopine katehola, dobro promućkajte i prelijte u kivetu kolorimetra. Pomoću te epruvete podesite kolorimetar da vrijednost apsorbancije bude nula, koristeći zeleni filtar. Nakon baždarenja, katehol redom unesite u sve epruvete. Apsorbancija (A) se odčitava svakih 15 sekundi tijekom jedne minute, a rezultati se unose u tablicu.

Rezultate prikažite grafički nanoseći na os ordinate volumen dodanog ekstrakta krumpira, a na os apscise brzinu enzimske reakcije (srednja vrijednost apsorbancije, ΔA/min). Iz podataka iz tablice i grafa izvedite zaključke kako koncentracija enzima utječe na brzinu reakcije.